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樣品的照明是在顯微鏡和顯微攝影的關(guān)鍵實(shí)現高品質(zhì)影像的最重要的變量�？评照彰魇怯煽�爾蔡司公司的奧古斯特·科勒在1893年首次推出為提供最佳的標本照明的方法。

由現代實(shí)驗室顯微鏡的所有制造商推薦的這種技術(shù)，因為它可以產(chǎn)生標本照明即從眩光均勻光亮和無(wú)，從而允許用戶(hù)實(shí)現對顯微鏡的全部潛力。

制造商已經(jīng)設計現代顯微鏡使內置在顯微鏡的基座集電極透鏡和任何其它光學(xué)元件將投射燈絲的放大和聚焦的圖像投影到一個(gè)適當定位臺下聚光的孔徑光闌的平面。關(guān)閉或打開(kāi)所述聚光鏡膜片控制所述光線(xiàn)從聚光鏡新興并到達從所有方位角樣品的角度。因為光源不聚焦在樣品的水平，在檢體水平的光基本上是grainless和擴展和聚光鏡的玻璃表面上不會(huì )受到灰塵和瑕疵的惡化。聚光鏡孔徑光闌的開(kāi)閉控制角的光錐到達樣品。聚光鏡的孔徑光闌的設置，與物鏡的口徑一起確定顯微鏡“系統” 實(shí)現的數值孔徑。作為聚光鏡光圈被打開(kāi)，在顯微鏡的工作數值孔徑增大，產(chǎn)生更大的分辨能力和光透射率。穿過(guò)并照亮樣品平行光線(xiàn)被帶到聚焦在物鏡，其中所述可變電容器孔徑光闌和光源的圖像的圖像將在焦點(diǎn)中可以看出的后焦平面。

在圖1所示的光通路被示意性繪制以表示由檢體照射光射線(xiàn)和成象光線(xiàn)采取不同的路徑。這不是這些途徑的任何實(shí)際偏析的真實(shí)再現，但提出了用于可視化和討論的目的的示意圖。圖1（a）示出了用于照明光在臺下聚光器孔徑光闌，物鏡的后焦面的平面產(chǎn)生的燈絲的聚焦圖像的射線(xiàn)路徑，并且視點(diǎn)（也稱(chēng)為冉斯登盤(pán)）目鏡。是在共同焦點(diǎn)這些區域通常被稱(chēng)為共聚面 ，這是實(shí)現正確的科勒照明至關(guān)重要。根據定義，一個(gè)對象，它是在聚焦在一個(gè)平面上也是焦點(diǎn)在該光路的其他共聚平面。在每個(gè)光通路（包括圖像形成和照明），有四個(gè)分開(kāi)的平面，它們一起構成了共聚面集合。

共聚面在科勒照明的照明光（圖1（a））包括的路徑：

• 燈絲。

• 聚光鏡孔徑光闌（在聚光鏡的前焦面）。

• 物鏡的后焦平面。

• 視點(diǎn)目鏡（也稱(chēng)為拉姆斯登片），其位于大約二分之一英寸（一個(gè)厘米）的目鏡的頂端透鏡上面，在那里的觀(guān)察者置于觀(guān)察時(shí)的眼睛的前部的點(diǎn)。

同樣地，在圖像形成光路中的共聚面中科勒照明（圖1（b））包括：

• 視場(chǎng)光闌。

• 聚焦標本。

• 在中間像平面（即，目鏡的固定光闌的平面）。

• 眼睛的視網(wǎng)膜或照相機的膠片平面。

共聚焦平面通常在故障排除在光學(xué)元件污染灰塵，纖維和不完善的顯微鏡是有用的。 如果這些文物是在大家關(guān)注的焦點(diǎn)，因此，它們必須駐留或表面，形成影像集共聚平面的一部分附近。 該組的成員包括在顯微鏡的光端口玻璃元件，樣品，在目鏡標線(xiàn)片，和目鏡的底部透鏡元件。 另外，如果這些污染物是模糊和失焦，尋找他們的照明組共享共聚平面元素的附近。 這一類(lèi)嫌疑犯是聚光頂端透鏡（其中灰塵往往積累），暴露的目鏡透鏡元件（從睫毛污染物），和物鏡前透鏡（通常指紋污跡）。

圖2示出一個(gè)典型的顯微鏡設置，其中在燈殼體（照明源）是通過(guò)在顯微鏡基鏡面反射后連接到基座和投射光通過(guò)幾個(gè)透鏡，然后通過(guò)臺下聚光鏡。光源本身應前中心或定心到顯微鏡的光軸。從鎢 - 鹵素燈燈絲發(fā)射的光首先穿過(guò)靠近燈室內，然后通過(guò)更接近視場(chǎng)光闌的第二透鏡的集光透鏡。通常，燒結或磨砂玻璃濾波器被放置在燈和集電極透鏡漫射光，并確保照明的均勻強度之間。在實(shí)踐中，燈絲的圖像聚焦到聚光器的前焦面，而在擴散玻璃被暫時(shí)從光路中移除。集電極透鏡的焦距必須小心地匹配于燈絲的尺寸，以確保適當大小的一個(gè)燈絲圖象被投影到聚光鏡孔。為適當的科勒照明，燈絲的圖像應完全填滿(mǎn)聚光鏡光圈。

在光路中的第二透鏡被稱(chēng)為場(chǎng)透鏡，它負責使燈絲的圖像聚焦在臺下聚光器孔徑光闌的平面。聚焦光離開(kāi)場(chǎng)透鏡是通過(guò)視場(chǎng)光闌的反射鏡（定位在45度角的光路），并進(jìn)入臺下聚光反射。視場(chǎng)光闌用作光為顯微鏡的虛擬源及其圖像被聚光到樣品平面聚焦。對于這些元件的布置的光學(xué)設計可以通過(guò)顯微鏡的制造商而變化，但場(chǎng)光闌應在從場(chǎng)透鏡足夠的距離被定位以從在樣品的平面被成像消除灰塵和透鏡的缺陷。

在顯微鏡的基視場(chǎng)光闌只控制的光線(xiàn)到達聚光鏡束的寬度-它不影響光學(xué)分辨率，數值孔徑，或照明的強度。視場(chǎng)光闌的適當的調整（即，在光路中心和打開(kāi)以位于外面的視場(chǎng)）是用于防止眩光重要比可以減少所觀(guān)察到的圖像中的對比度。試圖圖像樣本與固有的低對比度時(shí)過(guò)量的光的消除是特別重要的。當視場(chǎng)光闌打開(kāi)太多，從樣品散射的光始發(fā)和反射光從光學(xué)表面傾斜角度可起到降低圖像質(zhì)量。

臺下聚光鏡通常直接安裝在一個(gè)支架上的顯微鏡載物臺，可以通過(guò)旋轉滾花旋鈕升高或階段的獨立地降低，如在圖2中孔徑光圈被打開(kāi)說(shuō)明和任一擺臂封閉的下方，一桿，或由聚光殼體上旋轉的軸環(huán)。應當指出的是，臺下聚光鏡正確調整可能是實(shí)現正確科勒照明的最關(guān)鍵的方面。 然而不幸的是，聚光鏡偏差和調整不當聚光鏡孔徑光闌的圖像退化和顯微攝影質(zhì)量差的主要來(lái)源。

當適當調整，從聚光鏡的光將通過(guò)投影光錐來(lái)照明視場(chǎng)填補成象光的物鏡的后焦平面（的詳細討論臺下聚光鏡被包括在引物的另一部分）。聚光鏡孔徑光闌是負責控制照明光錐的角度，因此，在數值孔徑的聚光的。這個(gè)概念在圖3中，其中的一系列聚光鏡與減小尺寸從左至右在圖中的光錐（和數值孔徑）示出說(shuō)明。聚光光錐形狀也校正所證明在下面的交互式Java教程的光學(xué)像差的程度的函數：

圖3（a）表示數值孔徑約1.20，因而具有廣闊的光錐可以與高數值孔徑物鏡的標本攝像裝置的聚光鏡。 圖3（BD）顯示如何減小孔徑光闌的大小會(huì )產(chǎn)生光錐的尺寸和數值孔徑（如圖3（b） NA = 0.60的相應減少;如圖3（c） 的NA = 0.30;圖3（d ）NA = 0.15）。 我們還構建了一個(gè)交互式Java教程演示聚光光錐的大小和形狀如何隨數值孔徑的變化而變化。

要注意，對于大小和聚光鏡光錐的形狀是很重要的，這減少了視場(chǎng)光闌的大小僅用于略微減小光錐的在圖3中的角度和數值示出的下部的尺寸光錐的光圈依然有減少視場(chǎng)光闌的大小基本保持不變。另一個(gè)重要的概念，通常由新手忽視，是照明的強度不應通過(guò)開(kāi)閉聚光鏡孔徑光闌，也不是由相對于軸向移動(dòng)聚光鏡到顯微鏡的光學(xué)中心的控制。光照強度應該只通過(guò)使用放入光路的中性密度過(guò)濾器或通過(guò)降低電壓到燈（盡管后者通常不推薦的，尤其是對顯微攝影）來(lái)控制。以確保鎢鹵素燈的最大性能，指的是制造商的儀器手冊，以確定最佳的燈電壓（通常為6-10伏特），并使用該設置。照明亮度然后可通過(guò)添加或移除中性密度濾波器來(lái)容易地控制。

臺下聚光鏡孔徑光闌的尺寸不應該只與所需的數值孔徑一致，而且所產(chǎn)生的圖像的質(zhì)量應予以考慮。 通常，孔徑光闌應調整，以提供足夠的圖像的對比度而不被關(guān)閉，以引入分辨率和細節的損失的點(diǎn)。 折射率和固有標本對比度是確定孔徑光圈的尺寸非常重要的。 在一般情況下，光圈應設置的位置，使整個(gè)光盤(pán)大小的60％至90％（在除去目鏡一個(gè)伯特蘭透鏡或后眼管可見(jiàn)），雖然這可能與在樣品相反的極端變化。

上通過(guò)顯微攝影捕獲的圖像的質(zhì)量聚光鏡光圈設置的影響在圖4中示出的檢體是椴樹(shù)（椴）的薄部干染色用固綠和曙紅，并用40倍平場(chǎng)消色差物鏡上FUJICHROME 64T透明膠片拍攝（NA = 0.75）和擺動(dòng)出頂級鏡頭消色差聚光鏡（NA = 0.90）。 近似聚光鏡光圈開(kāi)口設置有：如圖4（a） - 90％的（NA = 0.81）; 如圖4（b） - 60％（NA = 0.54）; 圖4的（c） - 20％（NA = 0.18）。 該組織部分選擇顏色染色透露細節和分化子細胞成分觀(guān)察。

在如圖4（a），其中孔徑光闌被設置在其中，聚光鏡和物鏡的數值孔徑是幾乎相等的位置處，大部分的細樣品的細節是可見(jiàn)的，盡管仍然存在著(zhù)相當量的散射和眩光。圖象也比其對應，將其用孔徑光闌的較小設置所做顯著(zhù)亮。圖4（b）示出在大約產(chǎn)生的數值孔徑的70％，該物鏡的聚光鏡孔徑大小的椴樹(shù)莖。眩光降低，圖像非常清晰，精細的圖像細節存在不顯著(zhù)衍射文物。對于這種樣品，圖4中的顯微照片（b）表示用于聚光鏡孔徑光闌的最佳設定。當光圈是在物鏡的數值孔徑為約25％的封閉的最小設定（圖4（c）），精細的圖像細節變得模糊不清與衍射偽像和折射現象。圖像也需要對產(chǎn)生的樣品的顏色色調的變化較暗整體鑄造。這個(gè)概念可以更詳細地使用在臺下互動(dòng)式Java教程探索聚光鏡孔徑光闌 。

從上面的討論很明顯，聚光鏡的孔徑光闌應設置的位置，將提供依賴(lài)，在相當大的程度，對樣品的吸收，衍射，以及折射特性直接和偏離的光的折衷混合物。這必須沒(méi)有與文物，晦澀的細節和對比度當前錯誤增強鋪天蓋地的圖像來(lái)完成。圖像細節和必要，以產(chǎn)生最佳顯微照片對比度的量還取決于折射率，光學(xué)特性和其他檢體相關(guān)的參數。

當孔徑光闌被錯誤太多閉合，偏離光開(kāi)始模糊直接照射光線(xiàn)，產(chǎn)生衍射偽像導致可見(jiàn)條紋，帶，和/或在顯微照片圖案形成。其他的問(wèn)題，比如折射現象，也可以產(chǎn)生的圖像中的明顯的結構，這是不實(shí)際�；蛘�，打開(kāi)聚光鏡光圈太寬導致從內鏡下標本和光學(xué)表面多余的眩光和光散射。這導致對比度和清洗的顯著(zhù)損失出的圖像的細節。正確的設置將樣品而異標本，并且經(jīng)歷顯微鏡將很快學(xué)會(huì )通過(guò)觀(guān)察圖像精確調節聚光鏡孔徑光闌（和系統的數值孔徑），而無(wú)需在物鏡的后焦平面，以查看振動(dòng)板。事實(shí)上，許多顯微鏡認為顯微鏡系統，以?xún)?yōu)化圖像質(zhì)量的數值孔徑的臨界還原是在顯微攝影的一個(gè)最重要的步驟。

顯微鏡的照明系統中，當調整適當的科勒照明，必須滿(mǎn)足幾個(gè)要求。樣品平面的照射區域必須至少為視圖對于任何給定物鏡的數值孔徑一樣大。另外，光必須是均勻的強度的和數值孔徑必須從最大值（等于物鏡的）來(lái)表示將取決于樣品的光學(xué)特性的最小值而變化。表1包含物鏡的數值孔徑與視圖視場(chǎng)（對于場(chǎng)號18的目鏡）的每個(gè)物鏡，范圍從非常低到非常高的放大倍率的列表。

平場(chǎng)消色差平場(chǎng)消色差平場(chǎng)消色差平場(chǎng)消色差平場(chǎng)消色差平場(chǎng)消色差平場(chǎng)消色差平場(chǎng)復消色差透鏡平場(chǎng)復消色差透鏡平場(chǎng)復消色差透鏡

指定物鏡	數字 光圈	查看直徑場(chǎng)
1X	0.04	18.0
2倍	0.06	9
4倍	0.10	4.50
5倍	0.15	3.60
10倍	0.25	1.80
20倍	0.40	0.90
40倍	0.65	0.45
50倍	0.90	0.36
60X	0.95	0.30
100X	1.40	0.18

表格1

從表1中呈現的數據，很明顯，鑒于視場(chǎng)直徑的變化是100倍來(lái)自1x 平場(chǎng)消色差到100倍平場(chǎng)復消色差透鏡。這產(chǎn)生在1x和100倍的物鏡之間的照明的區域驚人10,000倍的差異。這種寬范圍的照明區域的需要，以適應所有的倍率調整在光路許多組件。這些計算是在假定18的目鏡場(chǎng)號，但許多現代顯微鏡配備有具有20個(gè)或25視圖視場(chǎng)的場(chǎng)數大視野目鏡（如表1中的三欄給出）可以被重新計算為任何目鏡使用下面的公式：

D =（FN）/ M

其中D是視場(chǎng)的直徑，FN是目鏡場(chǎng)數，M是的物鏡放大倍率。

現代顯微鏡配備有具有一個(gè)開(kāi)式透鏡，其可以從（通過(guò)5倍2倍），用于與低倍率的物鏡用途的光路中移除專(zhuān)門(mén)臺下聚光鏡。這改變了光路的其余部件的性能，并且一些調整是必要的，以達到最佳的照明條件。視場(chǎng)光闌不能再用于臺下聚光器的對準和居中并且現在是在限制在照明下的樣品的面積是無(wú)效的。此外，大部分不希望的眩光一旦通過(guò)視場(chǎng)光闌除去的降低，因為在聚光鏡的頂部透鏡產(chǎn)生具有低得多的數值孔徑的光錐，允許光線(xiàn)穿過(guò)樣品在低得多的角度通過(guò)。最重要的是，科勒照明光學(xué)條件不再適用。

顯微鏡的光學(xué)元件和建立科勒照明條件下的走線(xiàn)應始終處于較高（10倍）的放大倍率在較低的去除工作外擺式聚光鏡（5倍及以下）的放大倍率前進(jìn)行。聚光鏡的高度應然后不被改變。當擺式取下鏡頭，聚光性能徹底改變。燈絲的圖像不再形成在孔徑光闌，該停止控制聚光鏡和照明系統的數值孔徑。事實(shí)上，孔徑光闌應完全打開(kāi)，以避免漸暈，光在視場(chǎng)的邊緣逐漸褪色。

在低倍率顯微鏡系統為透過(guò)光的改性光通路在圖5中所示的視場(chǎng)光闌現在定位在正確的平面作為孔徑光闌，以控制數值孔徑的光錐的尺寸和形狀照明和成象光線(xiàn)穿過(guò)聚光鏡。裝入物鏡，而不是后焦面的檢體平面與等角圓錐（如在科勒照明），但是燈絲現在成像在后透鏡充分照射。

值得注意的是，視場(chǎng)光闌的圖像不再形成在樣品平面上，雖然照明的整體強度仍然在視野內均勻，設置在燈的聚光透鏡稍微擴散（化學(xué)蝕刻）或磨砂是很重要。在低倍顯微鏡視場(chǎng)光闌的新職務(wù)是一個(gè)的話(huà)題交互式Java教程的標本對比度調整在低倍率。

在低倍顯微鏡對比度調整用高倍率的物鏡是類(lèi)似的程序，如在圖4所示。當視場(chǎng)光闌是敞開(kāi)的（大于80％），樣品細節洗出和散射的一個(gè)顯著(zhù)量和眩光當下。閉視場(chǎng)光闌到位置50和80％之間將產(chǎn)生關(guān)于樣品的對比度和景深的最佳折衷。專(zhuān)為低倍率的物鏡是在設計上比他們更高的放大倍率同行顯著(zhù)簡(jiǎn)單。這是由于照明由低倍率聚光鏡，其需要較低的數值孔徑的物鏡產(chǎn)生的光錐的小角度。

測量標線(xiàn)片，它必須是在銳聚焦的并疊加在樣品的圖像上，可以插入到幾個(gè)上面討論的共聚平面。最常見(jiàn)的目鏡（眼）測量和顯微攝影掩模版被放置在中間像平面，這是目鏡內的固定光闌。這在理論上是可能的也放置掩模版在樣品平面或在照明場(chǎng)膜片的平面。階段微米是專(zhuān)門(mén)“掩模版”放置在測微尺，其用于校準目鏡標線(xiàn)片，并以使樣品的測量。放置掩模版中的視場(chǎng)光闌的平面從未做過(guò)（據我們所知），將需要非常高的校正的聚光鏡用于像差完全消除偽像和用于測量提供鮮明的圖像。

彩色和中性密度濾波器常常放置在光學(xué)路徑中，以減少光強度并改變照明的顏色特性。有顯微鏡支架，其中這些過(guò)濾器通常被放置在多個(gè)位置。一些現代實(shí)驗室顯微鏡具有夾在燈殼和集光透鏡，作為對這些過(guò)濾器的理想位置之間的過(guò)濾器支架。通常情況下，用色彩校正濾鏡和磨砂擴散過(guò)濾器沿著(zhù)中性密度濾鏡放在一起在這個(gè)過(guò)濾器支架。其他顯微鏡的設計提供一組內部構建成可以通過(guò)一個(gè)杠桿裝置被切換到光路徑主體的過(guò)濾器。為過(guò)濾器的第三公共位置是安裝在臺下聚光鏡底部，比孔徑光闌顯著(zhù)下，將接受的明膠或玻璃過(guò)濾器的保持器。

不放置過(guò)濾器內或附近的任何圖像形成共聚平面的，以避免在過(guò)濾器上的灰塵或表面缺陷與樣品一起待成像是非常重要的。有些顯微鏡對在該基地將過(guò)濾器附近的光口（近場(chǎng)光闌）的附件。這個(gè)位置可能是太靠近視場(chǎng)光闌，和表面污染可能是在大家關(guān)注的焦點(diǎn)，或出現疊加到圖像模糊偽影。這也是不明智的直接放在過(guò)濾器在顯微鏡舞臺出于同樣的原因。